Các bước phát triển phương pháp HPLC

Thứ năm - 28/05/2020 23:05
Phát triển phương pháp phân tích được coi là một quá trình quan trọng trong dược phẩm. Sự sẵn có của các loại cột khác nhau, thông số vận hành, thành phần pha động, giá trị pha loãng và pH làm cho nó rất quan trọng để phát triển một phương pháp phân tích. Một phương pháp phân tích tốt nên đơn giản, cột được sử dụng, pha động và bộ đệm nên phổ biến. Nó có thể được thực hiện dễ dàng từng bước.

Sau đây là các bước phát triển phương pháp HPLC phổ biến.
1. Lựa chọn phương pháp phân tích HPLC
2. Lựa chọn điều kiện sắc ký
3. Tối ưu hóa tham số

1. Lựa chọn phương pháp phân tích HPLC: Trước hết hãy tham khảo tài liệu có sẵn trên sản phẩm. Nó sẽ giúp bạn hiểu bản chất của sản phẩm sẽ giúp chọn các thông số khác nhau.
HPLC system
HPLC system
A. Chuẩn bị mẫu: Chọn phương pháp để chuẩn bị mẫu theo độ hòa tan, yêu cầu lọc, yêu cầu chiết hoặc các yêu cầu đặc biệt khác để đưa ra giải pháp phân tích HPLC rõ ràng.

B. Sắc ký: Sắc ký pha đảo được sử dụng cho hầu hết các mẫu nhưng khi có các phân tử axit hoặc bazơ trong mẫu thì khử ion ngược pha (đối với axit yếu hoặc bazơ) hoặc ghép ion ngược pha (đối với axit hoặc bazơ mạnh) được dùng. Pha tĩnh nên được liên kết C18. Pha thông thường được sử dụng cho chất phân tích phân cực thấp hoặc trung bình, đặc biệt khi cần phải tách các đồng phân sản phẩm. Chọn pha liên kết cyano để tách pha bình thường. Sắc ký trao đổi ion là tốt nhất để sử dụng cho phân tích anion hoặc cation vô cơ. Nếu chất phân tích có trọng lượng phân tử cao hơn sắc ký loại trừ kích thước là tốt nhất để sử dụng.

C Gradient/Isotonic HPLC: Gradient HPLC is helpful in the analysis of complex samples having a number of components. It will help to get higher resolution than isotonic HPLC having constant peak width while in isotonic HPLC peak width increases with the retention time. Gradient HPLC has great sensitivity, especially for the products having longer retention time.

D. Column Size: 100-150 mm columns are used for most of the samples. It reduces the method development and analysis time for the sample. Bigger columns are used for complex samples those take more time in separation. Initially, a flow rate should be kept between 1 and 1.5 ml/min and column particle size should be between 3 and 5 µm.

E. HPLC Detectors: If the analyte has chromophores that enable the compound to be detected by UV than it is better to use UV detector. It is always better to use a UV detector than others. Fluorescence and electrochemical detectors should be used for trace analysis. Samples having high concentration should be analyzed using refractive index detectors.

F. Bước sóng: λmax của mẫu có độ nhạy lớn nhất với tia UV. Nó phát hiện các thành phần mẫu có chromophores. Bước sóng trên 200nm cho độ nhạy cao hơn bước sóng thấp hơn. Bước sóng thấp hơn 200nm cho nhiều nhiễu hơn, do đó, cần tránh.

2. Lựa chọn điều kiện sắc ký: Sau khi lựa chọn phương pháp phân tích, các điều kiện sắc ký khác nhau được chọn.
Dòng chảy của chất phân tích qua cột phụ thuộc vào nồng độ của dung môi trong pha động. Nồng độ của dung môi thường được sử dụng để kiểm soát thời gian lưu. Thuốc thử ghép cặp pH và ion di động cũng ảnh hưởng đến thời gian lưu của mẫu. Các mẫu có số lượng lớn các thành phần được phân tích bằng cách sử dụng gradient để tránh thời gian lưu lớn trong khi các mẫu chứa một hoặc hai thành phần được phân tích trên hệ thống đẳng trương.

3. Tối ưu hóa tham số: Sau khi lấy cùng một mẫu, chạy một số tham số bao gồm kích thước cột, kích thước hạt, thời gian chạy và tốc độ dòng chảy được tối ưu hóa. Nó được thực hiện để có được độ phân giải tốt nhất và thời gian chạy tối thiểu.

Sau khi tối ưu hóa đúng phương pháp phân tích, nó được xác nhận để đảm bảo tính nhất quán của phương pháp phân tích. Xác nhận phương pháp phân tích hiện được thực hiện bắt buộc bởi tất cả các cơ quan quản lý.

Tổng số điểm của bài viết là: 10 trong 2 đánh giá

Xếp hạng: 5 - 2 phiếu bầu
Click để đánh giá bài viết

  Ý kiến bạn đọc

Bạn đã không sử dụng Site, Bấm vào đây để duy trì trạng thái đăng nhập. Thời gian chờ: 60 giây