Quy trình hiệu chuẩn HPLC

Thứ sáu - 29/05/2020 01:22

Biết quy trình hiệu chỉnh sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) bao gồm kiểm tra rò rỉ, tốc độ dòng chảy, độ tái lập và tuyến tính, năng lượng đèn và giảm áp suất bơm trong Kiểm soát chất lượng dược phẩm.

Kiểm tra sắc ký HPLC (Bơm) để biết các thông tin sau:
I. Điểm kiểm tra: Kiểm tra rò rỉ (Bằng cách giảm áp suất)
II. Hiệu chuẩn tốc độ dòng chảy
Điểm kiểm tra: Kiểm tra dò rỉ (Giảm áp đột ngột)
1. Đảm bảo rằng, thiết bị đã sẵn sàng để hiệu chuẩn và được tuân thủ quy trình Khởi động.
2. Đặt ống đầu vào của Bơm vào cấp HPLC nước thông qua bộ lọc hút.
3. Cho phép pha động di chuyển trong khoảng 5 phút.
4. Sử dụng vít để bịt đầu ra
5. Áp suất tăng và khi vượt quá 300 bar, lỗi xuất hiện “ERROR P-MAX”, trên cửa sổ hiển thị. Ghi chú thời gian. Nhấn phím CE và quan sát mức giảm áp trong 5 phút.
6. Sau 5 phút, ghi lại áp suất trong Nhật ký hiệu chuẩn.
7. Thực hiện việc sử dụng cột HOLC trong Thanh ghi nhật ký sử dụng cột.
8. Nhập mục của người dùng vào Sổ đăng ký sử dụng thiết bị.
9. So sánh kết quả về sự tuân thủ của nó với giới hạn được đưa ra trong Nhật ký hiệu chuẩn và đưa ra nhận xét liên quan đến Trạng thái hiệu chuẩn sắc ký HPLC.
10. Trong trường hợp không đạt, hãy thực hiện Chương trình bảo trì

Quy trình hiệu chuẩn tốc độ dòng trên sắc ký lỏng

1. Đảm bảo rằng, thiết bị đã sẵn sàng để hiệu chuẩn và quy trình Khởi động được tuân thủ.
2. Đảm bảo rằng, bơm dung môi đã hoàn thành Thử nghiệm rò rỉ (Giảm áp suất).
3. Giữ ống Xả theo cách sao cho giọt pha động (Nước) rơi vào bình định mức khô, sạch 10 ml mà không chạm vào thành bình và bắt đầu ngay lập tức đồng hồ bấm giờ khi giọt đầu tiên rơi vào bình.

4. Đợi cho đến khi pha động thu được đạt đến 10 ml bình định mức và Dừng đồng hồ bấm giờ.
5. Ghi lại thời gian cần thiết để thu thập pha động 10 ml trong nhật ký hiệu chuẩn.
6. Lặp lại quy trình cho tốc độ dòng 1,0 ml, 1,5 ml và 2,0 ml / phút..
7. Lặp lại bước 3 đến 6 nhưng sử dụng loại metanol HPLC làm pha động thay vì nước.
8. So sánh kết quả về sự tuân thủ của nó với các giới hạn được đưa ra trong Nhật ký hiệu chuẩn và đưa ra nhận xét liên quan đến Trạng thái hiệu chuẩn.
9. Nhập mục sử dụng của thiết bị và cột HPLC trong Thanh ghi nhật ký sử dụng thiết bị và Đăng ký nhật ký sử dụng cột tương ứng.
10. Chuẩn bị Nhãn trạng thái hiệu chuẩn và hiển thị trên thiết bị tại nơi được chỉ định.
11. Trong trường hợp không đạt tiêu chuẩn, hãy thực hiện bảo trì thiết bị.

Độ lặp lại và độ tuyến tính của thể tích tiêm mẫu
Chuẩn bị dung dịch trộn

1. Lấy bình định mức 50 ml sạch và khô.
2. Dùng pipet lấy 1,0 ml Benzen và Toluen cho vào bình định mức 50 ml sạch và khô.
3. Tạo thể tích đến 50 ml bằng Metanol và trộn đều.

Điều kiện sắc ký
Cột HPLC: ODS C18, (25 cm x 4,6 mm ID, 5 Laum)
Pha động: Methanol: Nước (70: 30)
Tốc độ dòng: 1,0 ml / phút.
Bước sóng: 254nm
Thể tích tiêm: 20

Hiệu chuẩn

1. Đảm bảo rằng, thiết bị đã sẵn sàng để hiệu chuẩn và quy trình Khởi động được tuân thủ.
2. Đảm bảo rằng, thiết bị được đặt theo các điều kiện Sắc ký.
3. Thực hiện theo quy trình Vận hành Thiết bị, Tiêm 3 lần 10 uL và ghi lại sắc ký đồ.
4. Lặp lại việc tiêm dung dịch trên bằng cách tiêm 3 lần các thể tích 15, 20, 25, 30 uL.
5. Lấy bản in ra khỏi sắc ký đồ và đính kèm vào Nhật ký hiệu chuẩn.
6. Ghi lại diện tích và thời gian lưu của các đỉnh Benzen và Toluen trong Nhật ký hiệu chuẩn.
7. Nhập mục sử dụng của thiết bị và cột HPLC trong Thanh ghi nhật ký sử dụng công cụ và Đăng ký nhật ký sử dụng cột tương ứng.
8. Vẽ đường cong cho diện tích tương ứng các peak của Benzen đến đỉnh Toluene, Tìm ra RSD (độ lặp lại) và ghi lại trong Nhật ký hiệu chuẩn.
9. Tìm hiểu hệ số tương quan “r2” cho mỗi đỉnh ở năm cấp độ và ghi vào Nhật ký hiệu chuẩn.
10. So sánh kết quả với giới hạn được đưa ra trong Nhật ký hiệu chuẩn và đưa ra nhận xét liên quan đến Trạng thái hiệu chuẩn.
11. Chuẩn bị Nhãn trạng thái hiệu chuẩn và hiển thị trên thiết bị tại nơi được chỉ định.
12. Trong trường hợp không đạt, hãy thực hiện việc bảo trì thiết bị

Điểm kiểm tra: Kiểm tra năng lượng đèn D2 (Detector)
1. Đảm bảo rằng, thiết bị đã sẵn sàng để hiệu chuẩn và quy trình Khởi động được tuân thủ.
2. Trên cửa sổ hiển thị của Detector, một số giá trị tại các chức năng, “l(nm)”, “abs(AU)”, “range(AUFS)” and “lamp” xuất hiện.
3. Trên màn hình, giá trị cài đặt trước đó sẽ nhấp nháy tại chức năng “l(nm)”, nhập bước sóng 254nm bằng cách nhấn các phím số.
4. Nhấn phím “Func Back” và chọn các chức năng “lamp”, nhập 1 để chọn đèn D2.
5. Nhấn thêm phím “Func Back” cho đến khi “REF EN ” xuất hiện.
6. Ghi lại năng lượng tham chiếu của đèn D2 ở bước sóng 254nm trong Nhật ký hiệu chuẩn.
7 So sánh kết quả về sự tuân thủ của nó với giới hạn được đưa ra trong Nhật ký hiệu chuẩn và đưa ra nhận xét liên quan đến Trạng thái hiệu chuẩn.
8. Trong trường hợp không đạt, hãy thực hiện việc bảo trì thiết bị

III. Mức đáp ứng độ tuyến tính của detector
Chuẩn bị dung dịch:
1. Lấy ba bình định mức 50 ml sạch và khô.
2. Dùng pipet theo ml Benzen và Toluen theo bảng sau vào bình định mức 50 ml sạch, khô.
3. Tạo thể tích đến 50 ml bằng Metanol và trộn đều.

Solution (Level)	ml of Benzene to be taken	Ml of Toluene to be taken	To be Diluted with Methanol to
1	0.5	1.0	50 ml
2	1.0	1.0	50 ml
3	1.5	1.0	50 ml

Điều kiện sắc ký
1. Cài đặt thiết bị theo các tham số sau theo Quy trình thiết lập tham số của thiết bị.
Cột HPLC: ODS C18, (25 cm x 4,6 mm ID, 5 m)
Pha động: Methanol: Nước (70: 30)
Tốc độ dòng: 1,0 ml / phút.
Bước sóng: 254nm
Thể tích tiêm: 20 uL

Hiệu chuẩn
1. Đảm bảo rằng, thiết bị đã sẵn sàng để hiệu chuẩn và quy trình Khởi động được tuân thủ.
2. Đảm bảo rằng, thiết bị được đặt theo các điều kiện Sắc ký.
3. Thực hiện theo quy trình Vận hành Thiết bị, Tiêm từng dung dịch ba lần và ghi lại sắc ký đồ.
4. Hãy in ra của sắc ký và gắn với hiệu chuẩn vào nhật ký hiệu chuẩn
5. Ghi lại diện tích và thời gian lưu của các đỉnh Benzen và Toluene trong Nhật ký hiệu chuẩn.
6. Nhập mục sử dụng của thiết bị và cột HPLC trong Thanh ghi nhật ký sử dụng nhạc cụ và Đăng ký nhật ký sử dụng cột tương ứng.

7. Tính tỷ lệ diện tích của Benzen với Toluene, Tìm ra giá trị trung bình của các tỷ lệ và ghi lại trong Nhật ký hiệu chuẩn.
8. Tìm hiểu hệ số tương quan “r2” từ các giá trị tỷ lệ diện tích trung bình của ba cấp độ và ghi vào Nhật ký hiệu chuẩn.
8. Vẽ đường cong cho tỷ lệ diện tích tương ứng của đỉnh Benzen và Toluene với nồng độ, Tìm ra RSD (độ lặp lại) và ghi lại trong Nhật ký hiệu chuẩn.
9. So sánh kết quả về việc tuân thủ theo giới hạn được đưa ra trong Nhật ký hiệu chuẩn và đưa ra nhận xét liên quan đến Trạng thái hiệu chuẩn.
10. Chuẩn bị Nhãn trạng thái hiệu chuẩn và hiển thị trên thiết bị tại nơi được chỉ định.
11. Trong trường hợp không đạt, hãy thực hiện việc bảo trì thiết bị

HIỆU CHUẨN BƠM CỦA MÁY HPLC (Liquid Chromatography)

Model No. :	Make :
Instrument Code No. :

A. Checkpoint : Leakage Check Test (Pressure Drop)

P.Max
to be set

P.Max Set

Start Time

Stop Time

Total Time

Pressure Observed

Remark

300 bar

B. Flow Rate calibration :

Flow Rate
(ml / min.)

Time required to collect 10 ml mobile phase

Limit

Remarks

Theoretical
(in sec.)

Actual with water

Actual with Methanol

0.5 ml

1200

1194 - 1206

1.0 ml

600

594 – 606

1.5 ml

450

443 – 457

2.0 ml

300

294 - 306

Calibration Status : Satisfactory / Not Satisfactory
Next Calibration Due :
Calibrated By: Checked By :
Date: Date:

HIỆU CHUẨN BỘ TIÊM MẪU TỰ ĐỘNG (INJECTOR)

Model: Make:
Instrument Code No.:

a. Preparation of solvent mixture :
Taken _____ ml (1.0 ml) of the ________ (Benzene) and ________ (Toluene) in to a _____ ml (50 ml) clean, dry volumetric flask, make up the volume with methanol, mixed well.

b. Chromatographic Condition :

Parameters	Test Condition	Applied Condition
Mobile Phase	Methanol: Water (70: 30)
HPLC Column	ODS C18, (25 cm x 4.6 mm ID, 5 µm)
Flow Rate	1.0 ml / min.
Wavelength	254 nm

Injection volume

Injection -1

Injection -2

Injection -3

Mean

% RSD :
(Not more than 2.0%)

Benzene

Toluene

Benzene

Toluene

Benzene

Toluene

10 ml

RT

Area

15 ml

RT

Area

20 ml

RT

Area

25 ml

RT

Area

30 ml

RT

Area

Coefficient of co-relations : r² : _____________ (Limit : NLT : 0.999)
Calibration Status : Satisfactory / Not Satisfactory
Next Calibration Due :
Calibrated By: Checked By :
Date: Date :

CALIBRATION OF DETECTOR

Model :	Make :
Instrument Code No. :

D2 LAMP ENERGY CHECK :
Wavelength to be set	Wavelength Set	Reference Energy Observed	Limit
254 nm			Not less than 200

LINEARITY OF DETECTOR RESPONSE :
a. Solution Preparation :
Solution	ml of Benzene		ml of Toluene		in Methanol
(Level)	To be taken	Taken	To be taken	Taken	To be diluted	Diluted to
1	0.5 ml		1.0 ml		50 ml
2	1.0 ml		1.0 ml		50 ml
3	1.5 ml		1.0 ml		50 ml

Mobile Phase Preparation : Taken ml of _ (Methanol HPLC grade) in to a _ ml clean, dry volumetric flask, added ____ ml of _(Water HPLC grade), mixed well, allowed to cool to room temperature. Filtered through 0.45/0.22 m membrane filter, degassed for _ min. by vacuum / sonication.

Parameters	Test Condition	Applied Condition
Mobile Phase	Methanol: Water ( 70: 30)
HPLC Column	ODS C18, (25 cm x 4.6 mm ID, 5 µm)
Flow Rate	1.0 ml / min.
Wavelength	254 nm
Range	1.0 AUFS
Injection Volume	20 µl

Solution (Level)	Benzene Area		Toluene Area		Area Ratio (Benzene/Toluene)
Solution (Level)	RT	Area	RT	Area	Area Ratio (Benzene/Toluene)
1


Mean :
% RSD :		---		---
2


Mean :
% RSD :
3


Mean :
% RSD :